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RT-PCR实验操作过程

YUEDUCISHU:72    FABUSHIJIAN:2019/12/31 14:17:57

RT-PCR实验操作过程

试验前注意:

1. 做RT前必需测RNA浓度,逆转录体系对RNA量还是有一些要求,常用500ng或1ug。

2. RT按要求做,一般不会出太大问题。

3. PCR如需扩长片段,则对前两步要求较高,需要有完整的cDNA存在,不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。

 

试验过程:

实验器具:

1、 移液枪:1ml、200μl、20μl、10μl、2μl

2、 吸头:1ml、200μl、20μl

3、 匀浆管:5ml

4、 吸头台:放置1ml吸头的一个,放置20μl吸头的一个

5、 EP管:1.5ml、0.2ml、100μl

6、 试剂瓶:2个60ml的棕色试剂瓶(广口,带盖)1个125ml的白色试剂瓶(放无水乙醇

7、 量筒:50ml、250ml、500ml

8、 容量瓶:250ml、500ml、1000ml

9、 试管架:5ml、1.5ml、20μl

10、 盐水瓶:250ml、500ml各2个备用,一个装无水乙醇,另一个装DEPC水

11、 铝制饭盒:4个

12、 塑料小饭盒:1个

13、 大瓷缸:2个

14、 锡泊纸:一卷

15、 卷纸:2卷

16、 三角烧瓶:带盖,稍大

 

实验器具的处理与准备:

1、 塑料制品:(包括枪头、EP管、匀浆管等)先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中,将塑料制品逐个浸泡其中,其中小枪头需要吸管打入DEPC水,过夜,然后高压,再烤干备用,实验前将枪头等放入吸头台,再高压一次(EP管)。

2、 玻璃制品:泡酸过夜,冲洗干净,蒙锡纸烤干备用(DEPC水泡)(洗净后先泡1‰DEPC过夜,再烤干)。

3、 匀浆器:(包括剪刀、镊子)先洗净后,再高压(不需要泡DEPC

 

试验试剂:

1、 DEPC水:吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水,放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。

2、 75%乙醇:用无水乙醇+DEPC水配,然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高压)。

3、 异丙醇:放入棕色瓶中。

4、 氯仿:放入棕色瓶中。

5、 琼脂糖

 

几种缓冲液的配制:

1、 电泳缓冲液: Tris? ?54g??硼酸 27.5g 0.5M EDTA 20ml pH8.0 蒸溜水 1000ml。

2、 5×TBE (贮存液)再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用(即工作液浓度),如取50ml贮存液加入450ml水——→500ml工作缓冲液。

3、 上样缓冲液:0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 30%甘油 6×缓冲液,4℃保存。


RT-PCR实验操作过程


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