山东快乐扑克3

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明胶酶谱试剂盒这样操作条带更清晰!

YUEDUCISHU:77    FABUSHIJIAN:2019/11/28 14:42:14

 明胶酶谱试剂盒这样操作条带更清晰!

 

MMP-2&MMP-9MINGJIAOMEIPUFAJIANCESHIJIHEXIANGGUANJIANJIE

山东快乐扑克3JIZHIJINSHUDANBAIMEI(matrix metalloproteinase, MMP)YIWUHUOXINGDEMEIYUANXINGSHIFENMI,HUOHUAHOUNENGGOUJIANGJIEXIBAOWAIJIZHIDEJIAOYUANDANBAI,YOUCHENGJIAOYUANMEI。TONGGUOYINGXIANGXIBAOWAIJIZHI,JIAOYUANMEICANYUPEITAIFAYU、XINGTAIFASHENG、ZUZHIZHONGSUDENGGUOCHENG,BINGCANYUYANZHENG、ZHONGLIU、XINXUEGUAN、SHENJINGDENGXUDUOJIBINGGUOCHENG。XUEJIANGYUZUZHIZHONGDEMMP-2、MMP-9CANYUGEZHONGSHENGLIYUBINGLIGUOCHENG,QIZAILINCHUANGZHENDUANHEZHILIAOZHONGDEYIYIRIYISHOUDAOZHONGSHI。

 

MMP-2&MMP-9MINGJIAOMEIPUFAJIANCESHIJIHEJIANCEBUZHOU


山东快乐扑克31、  制备含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝胶:推荐分离胶浓度为8%。按照标准程序制备SDS PAGE凝胶。将10 × substrate G 融化,并90 ºC 加热5分钟。分别在浓缩胶和分离胶中额外加入10 × substrate G 并使之稀释10倍,混匀后加入过硫酸铵和TEMED,等待凝胶聚合。


山东快乐扑克32、待测样品1:1 稀释于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制:4% SDS, 100 mM Tris-Cl  pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue),混合后直接上样。切勿加热变性,并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液。可通过预试验确定加样量,使用普通蛋白预染Marker 即可。

山东快乐扑克3YANGXINGDUIZHAO(KEXUANBUZHOU):KEQUREN、XIAOSHU、DASHUHUOTU100μl QUANXUEYU100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer DENGTIJIHUNHE,QU5-15μl SHANGYANG。


注:因为全血成分复杂,MMP活性较低,zui好的方法是将全血中白细胞进行分离做阳性对照


山东快乐扑克33、低电流恒流电泳,每一块小胶电流为20 mA/gel。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。


4、洗涤凝胶:取出凝胶,去除浓缩胶,放入容器内。可先用适量蒸馏水冲洗凝胶,然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸馏水稀释),室温漂洗凝胶2 × 30 分钟。中间换液。


5、 孵育:倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸馏水稀释),室温或37ºC 孵育1~5 小时。阳性对照或者血中的MMP 通常
37ºC 孵育1 小时即可显示。如MMP 活性低,应延长孵育时间为10小时或过夜。


山东快乐扑克36、显色:倒掉Buffer B,加入SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液(操作步骤见后面所附SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书)。凝胶的大部分区域被深染,在有MMP 条带的位置不被染色而形成透亮区域。

山东快乐扑克3TOUMINGQUYUDEWEIZHIHEFANWEIZHISHIMMP-2、MMP-9 DEDAXIAOWEIZHI(MEIPU)JIHUOXING。YANGXINGDUIZHAOJIANGZAI66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDaWEIZHICHUXIANTOUMINGTIAODAI。


山东快乐扑克37、条带扫描:将凝胶放在扫描仪上扫描。虽然MMP条带透明,但凝胶背景并非真正全黑。解决办法:可用非透射光扫描,或用软件图像处理程序调整背景显示为灰度显示,并尽量设置为黑色。MMP 条带则为白色,这种背景黑条带白的格式是英文论文中zui常见的格式。


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