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NADP苹果酸酶(NADP-ME)检测试剂盒操作方法!

阅读次数:71    发布时间:2019/8/20 17:08:48

NADP苹果酸酶(NADP-ME)检测试剂盒操作方法!


测定意义:ME广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中,尤其在植物组织中活性较高。ME催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应,产生丙酮酸和CO2,以及伴随NAD(P)+的还原反应,是苹果酸代谢的关键酶。ME活性与生物合成和抗氧化密切相关。近年来植物ME活性测定较多,已经成为抗氧化研究的热点。根据辅酶专一性和对底物特异性的不同,可将ME分为NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。

测定原理:NADP-ME催化NADP+还原成NADPH,在340nm下测定NADPH增加速率。


测定步骤:
1、紫外分光光度计/酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。
2、将试剂一在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)中保温 15min 左右。

将上述试剂按顺序加入微量石英比色皿/96 孔 UV 板中混匀,在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种),340 nm 波长下记录初始吸光度 A1 和反应 1min 后的吸光度 A2,计算ΔA=A2-A1。


注意事项:

1、若 A2-A1 大于 0.5,需将酶液用提取液稀释,使 A2-A1 小于 0.5,可提高检测灵敏度。

2、实验时,试剂三、试剂四和样本在冰上放置,以免变性和失活。试剂一 37℃或 25℃水浴放置。

3、比色皿中反应液的温度必须保持 37℃或 25℃,取小烧杯一只装入一定量的 37℃或 25℃蒸馏水,将此烧杯放入 37℃或 25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。用 96孔板做时尽量保持反应温度在 37℃或 25℃。

4、*两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。用 96 孔板做时尽量做到样本反应时间一致。

5、如果ΔA<0.01,可将反应时间延长 5 分钟或 10 分钟。


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